Джованни Альфонсо Борелли родился 28 января 1608 года в Кастель Нуово (предместье Неаполя) в семье испанского солдата. Учился в Риме, изучал медицину и математику у Кастелли (вместе с Торричелли). С 1635 года Борелли работал в университете Мессины. В 1649 году получил должность профессора математики.
Примерно в начале 1640-х годов познакомился с Галилеем. Борелли продолжил систематическое изучение открытых Галилеем спутников Юпитера. В своей книге «Теория Медичийских планет» он сделал исключительно важный на тот момент вывод, что для них, как и для планет, выполняются законы Кеплера. В этой же книге он сформулировал несовершенный, но принципиально верный вариант закона всемирного тяготения.
В 1656 году Борелли занял кафедру математики в Пизанском университете. Здесь он познакомился с врачом Марчелло Мальпиги, который одним из первых начал исследования с помощью микроскопа. Борелли также увлекся этой тематикой и получил ряд ценных результатов. Он изучал под микроскопом состав крови животных и работу устьиц растений.
Борелли впервые рассмотрел возможность создания дыхательного аппарата для подводных исследований. Борелли считается основоположником биомеханики.
Джованни Альфонсо Борелли скончался 31 декабря 1679 года в Риме. Его главный труд по биомеханике — «О движении животных», был издан посмертно в 1680 году.