Юрий Трофимович Тимошенко родился в Полтаве 2 июня 1919 года. Перед самым началом Великой Отечественной войны, в 1941 году, он окончил Киевский театральный институт.
Во время Великой Отечественной войны Тимошенко был членом ансамбля песни и танца Юго-Западного фронта, где он запомнился своими выступлениями в образе-маске банщика Мочалкина.
После окончания войны был придуман новый персонаж – милиционер Тарапунька, и Юрий Тимошенко стал выступать вместе с Ефимом Березиным (монтёр Штепсель) в очень популярном дуэте «Тарапунька и Штепсель». Этот дуэт представлял собой комическое смешение русского и украинского языков. Со временем они стали ставить целые эстрадные спектакли: «Везли эстраду на декаду», «Смеханический концерт», «Ровно 20 с гаком», «От и до» и другие.
Юрий Тимошенко снимался в кино, его дебютной ролью был репортер в фильме «Центр нападения», вышедшем на экраны в 1946 году. Также он снялся в роли Тарапуньки в трех комедийных фильмах: «Тарапунька и Штепсель под облаками» (1953), «Штепсель женит Тарапуньку» (1957), «Ехали мы, ехали…» (1962). В двух последних фильмах Юрий Тимошенко был также режиссером, а в фильме «Ехали мы, ехали…» – еще и сценаристом.
В 1950 году он был награжден Государственной премией СССР. В 1960 году Юрию Трофимовичу было присвоено звание Народного артиста Украинской ССР.
Скончался артист 1 декабря 1986 года, похоронен на Байковом кладбище Киева.