Евгений Валерианович Самойлов родился в Санкт-Петербурге 16 апреля 1912 года в рабочей семье. Родители Евгения обеспечили ему беззаботное и счастливое детство, привили сыну любовь к искусству, книгам, театру, живописи. Евгений развивал свой талант художника и мечтал о поступлении в Академию художеств.
В 1928 году «за компанию» он поступил в актёрскую студию, где занимался по вечерам у корифеев Александринского и Мариинского театров. После окончания школы Евгений поступил в Ленинградский художественный политехникум, а затем начал работу в Ленинградском Театре актерского мастерства, где он в основном играл стариков. Его первой заметной ролью стал Председатель укома (в пьесе «Шторм» В.Билль-Белоцерковского). В 1934 году после посещения театра Мейерхольдом Самойлов был приглашен в его театр.
Самойлов принял приглашение и переехал в Москву, а Мейерхольд со своей женой стали опекать молодого актёра. Самойлов был хорошим и способным учеником, он жадно впитывал все, что творилось в театре, посещал спектакли и учился у ведущих актёров театра: М.М. Тарханова, Б.В. Щукина, Р.Н. Симонова. Он сыграл роли Эрнани («Эрнани» В.Гюго) и Чацкого («Горе от ума» А.Грибоедова), Павки Корчагина («Одна жизнь» по роману «Как закалялась сталь» Н.Островского).
В 1934 году состоялся дебют артиста в кино, в лирической комедии «Случайная встреча» режиссера И.А. Савченко. Затем он снялся в фильмах «Том Сойер» режиссера Л.Френкеля, «Щорс» режиссера А.П. Довженко, Кирилла Ждаркина в фильме «В поисках радости» Г.Л. Рошаля, в роли инженера Лебедева в фильме «Светлый путь» Г.А. Александрова, Бурунова в фильме «Адмирал Нахимов» В.П. Пудовкина, Марченко в фильме «Они сражались за Родину» С.Ф. Бондарчука и других.
Одна из любимых ролей Самойлова – лейтенант Кудряш в фильме «В шесть часов вечера после войны» легендарного И.А. Пырьева, в которой он снялся в 1944 году. После выхода этого фильма на актёра обрушилась слава.
С 1968 года он играл в Малом театре, создав несколько десятков образов в пьесах классических и современных драматургов. В 1974 году Евгению Самойлову было присвоено звание Народного артиста СССР, он стал трижды лауреатом Сталинской премии, кавалером многих орденов и медалей.
Личная жизнь Евгения Самойлова сложилась успешно, 62 года он прожил со своей женой, Зинаидой Левиной, они воспитали сына и дочь – Алексея и Татьяну, которые также стали актёрами.
Скончался Евгений Валерианович Самойлов 17 февраля 2006 года.