Пенелопа Крус родилась 28 апреля 1974 года в Мадриде. Ее отец был мелким торговцем, а мать – парикмахером. С детства Пенелопа стала заниматься танцами и уже в девять лет поступила в Испанскую национальную консерваторию, где специализировалась в классическом балете.
Благодаря яркой внешности она с 15 лет стала появляться в телевизионных программах и музыкальных клипах. В 1991 году Пенелопа дебютировала в фильме «Греческий лабиринт». В следующем году она снялась в фильме «Эра красоты», получившем несколько испанских премий и приз Американской киноакадемии как лучший иностранный фильм.
Знаменитой же актриса стала намного позже, в 1997 году, сыграв в фильмах «Живая плоть» и «Открой глаза». С этого времени актрису приметил режиссер Педро Альмодовара и стал активно снимать ее в своих картинах.
В 1999 году фильм Альмодовара с Пенелопой Крус «Всё о моей матери» открыл Каннский кинофестиваль. Актриса снималась в паре с самыми знаменитыми актёрами: Мэттом Дэймоном («Неукротимые сердца»), Джонни Деппом («Кокаин»), Николасом Кейджем («Выбор капитана Корелли»), Сальмой Хайеком («Бандитки»), Томом Крузом («Ванильное небо») и другими.
В 2009 году Пенелопа Крус получила «Оскара» за лучшую женскую роль второго плана в фильме «Вики Кристина Барселона» режиссера Вуди Аллена. Как лучшая актриса второго плана она получила также премии BAFTA, «Независимый дух» и National Board of Review.