Василий Кочубей владел огромными земельными наделами с крепостными крестьянами на Левобережной Украине. При гетмане Мазепе он занимал высшие должности в Гетманском уряде: генерального писаря (1687-1699), генерального судьи (1699-1708). В составе украинских казацких войск участвовал в Азовских походах (1695-1696).
Узнав о тайных переговорах Мазепы со шведским королем Карлом XII и польским королем Лещинским, целью которых было отделение Украины от России и подчинение ее власти Швеции и Польши, Кочубей несколько раз предупреждал Петра I о готовившейся измене.
Однако царь, бесконечно доверяя Мазепе, счел сведения об его измене клеветой и выдал гетману бежавших в Россию Кочубея и его единомышленника полковника Искру. Их жестоко пытали и казнили 25 июля 1708 года. Когда же Петр узнал о побеге Мазепы к Карлу XII, он пришел в бешенство. После Полтавской победы князь Меньшиков получил строжайший приказ догнать и схватить предателя, но выполнить его не сумел – Карл XII и Мазепа ускользнули от русских отрядов и бежали в Турцию.
Желание казнить изменника было так велико, что вопреки своей обычной скупости Петр предлагал турецкому муфтию 300 тысяч талеров, если тот убедит султана выдать беглеца. Однако сделка не состоялась, а Мазепа умер своей смертью в 1709 году. Кочубей и Искра с почестями были похоронены в Киево-Печерской лавре.